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    2. 全自動定氮儀,凱氏定氮儀是蛋白質測定儀嗎?

      時間:2021/5/17 10:00:16 瀏覽:

      測定蛋白質含量的儀器有很多,如雙縮脲法、folin―酚試劑法、改良的簡易folin―酚試劑法、考馬斯亮蘭法、紫外吸收法、凱氏定氮儀是其中的一種測量儀器,他們之間的區別在于方法和適用性不一樣。我們一起來探討交流吧!全自動定氮儀

        1、雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經180℃左右加熱,放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。

        紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有:硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優點是較快速,不同的蛋白質產生顏色的深淺相近,以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質測定。

        2folin―酚試劑法(lowry法)這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較為困難(現在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即folin―酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。

        folin―酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點是費時間較長,要精確控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子,同樣容易干擾lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但這些物質濃度高時,必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉―氫氧化鈉溶液,即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色后會色淺,則必須提高碳酸鈉―氫氧化鈉溶液的濃度12倍。全自動定氮儀

        進行測定時,加folin―酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性ph條件下穩定,但上述還原反應只在ph=10的情況下發生,故當folin一酚試劑加到堿性的銅―蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸―磷鎢酸試劑被破壞之前,還原反應即能發生。也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg

        3、改良的簡易folin―酚試劑法a.試劑甲:堿性銅試劑溶液中,含0.5n NaOH10%Na2CO30.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅,配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后,最后加入。b.試劑乙:與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。c.標準蛋白質溶液:同基本法。

        4、考馬斯亮蘭法(bradford法),雙縮脲法(biuret法)和folin—酚試劑法(lowry法)的明顯缺點和許多限制,促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法(bradford法),是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點,因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭g-250染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm變為595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為,染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值a595,與蛋白質濃度成正比。

       

        5、紫外吸收法:蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質含量成正比。此外,蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系,可以進行蛋白質含量的測定。

        紫外吸收法簡便、靈敏、快速,不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如生化制備中常用的(NH42SO4等和大多數緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測,因為此時只需測定蛋白質濃度的變化,而不需知道其絕對值。

        此法的特點是測定蛋白質含量的準確度較差,干擾物質多,在用標準曲線法測定蛋白質含量時,對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質,有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質,會出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表,再進行計算的方法,加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經過校正,測定的結果還是存在一定的誤差。



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